DEPARTAMENT POLIMERI

Asa cum se stie, nitratii si nitritii sunt omniprezenti in mediu. Ei se gasesc in apa, animale, tesuturile plantelor, alimente si interviin in procesele industriale si fiziologice. Acesti compusi de azot patrund in apa din diferite surse: ingrasaminte, resturi animaliere, descompunerea plantelor, depuneri atmosferice. Nitratul poate intra in ape din ingrasaminte atat din zonele agricole cat si din gradinile caselor sau de pe terenuri de sport. Deoarece nitratul si nitritul sunt niste anioni ei nu se ataseaza la particulele de sol. Ca urmare sunt foarte mobili in sistemele apoase. Nitratul poate fi spalat din zonele cu ingrasaminte si transferat in ape. Studii recente au aratat ca compusii de azot eliberati in aer din procesele de combustie de catre automobile si industrie, pot sa mareasca continutul de nitrati din apa de ploaie si din pulberile depuse, reprezentand o alta sursa de nitrat in ape. In timpul proceselor de combustie la temperaturi inalte, ca in motoarele vehiculelor si in termocentralele pe combustibili fosili, o parte din azotul din aer este transformat in oxizi de azot (NO_x) (X= 1, 1.5 sau 2). Acesti compusi sunt emisi in aer, se oxideaza la nitrat si eventual sunt antrenati din atmosfera in timpul ploilor.

Nitratul este un poluant obisnuit din apa de baut. El are o concentratie maxima admisibila (CMA) de 10 mg/L ca azot si este raspunzator de boala methemoglobinemie, sau sindromul blue-baby, la copii. Exista o mare ingrijorare privind riscurile potentiale ale nitritilor datorita folosirii lor ca aditivi alimentari si capacitatii nitritilor de a reactiona in organism cu aminele pentru a forma nitrozamine cancerigene. Datorita potentialului toxic, in ultimii ani s-au dezvoltat mai multe metode de determinare a urmelor de nitrati si nitriti din ape. Dintre acestea cele mai avansate metode de monitorizare a nitratilor si nitrtilor din apa de baut se crede ca sunt biosenzorii, care permit monitorizarea continua in timp real, cu transmiterea datelor la distanta si cu posibilitatea de interventie automata in cazul depasirii concentratiilor maxime admisibile.

Lucrarile efectuate in prima etapa a proiectului au cuprins ample studii ale literaturii de specialitate si cercetari preliminare in vederea identificarii principiilor de baza ale realizariii noilor biosenzori pentru monitorizarea nitratilor si nitritilor.

Studiile de literatura s-au referit la cele mai importante aspecte privind imobilizarea enzimelor pe electrodul biosenzorilor, la metodele clasice de determinare a nitratilor si nitritilor, pentru a avea metode de comparare a preciziei noilor biosenzori si la diverse aspecte privind realizarea traductorilor enzimatici.

Astfel s-au urmarit stadiul mondial actual al cunoasterii privind nanobiocataliza (nanoincapsularea enzimelor in nanoparticule, imobilizarea enzimei in medii poroase prin tehnica: "ship in bottle", straturi de agregate enzimatice pe nanomateriale, biocataliza interfaciala, stabilitatea enzimelor si alte aplicatii potentiale ale nanobiocatalizei), imobilizarea de enzime pentru producerea de biosenzori (pe monostraturi autoasamblate, pe polimeri electroconductivi, pe nanomateriale, etc.), biocompatibilitatea intre senzor si enzima, exemple de biosenzori enzimatici, biosenzori pentru determinarea nitratilor si nitritilor, diferenta intre senzorii chimici si biosenzori, tipurile de electrozi utilizati in detectia nitratilor si nitritilor (mai ales biosenzorii amperometrici si electrozii ion selectivi), metodele analitice clasice de determinare a nitratilor si nitritilor din ape, cu accent pe polarografie, fluorescenta si metoda electrodului ion selectiv.

Cercetarile preliminare s-au referit la imobilizarea covalenta a peroxidazei hreanului (horseradish peroxidase - HRP) pe membrane de alcool povinilic, la obtinerea unor traductori SPE proprii si la evaluarea posibilitatii de determinare a nitratilor si nitritilor din ape prin doua metode HPLC.

S-a constatat ca metoda de obtinere a membranelor de alcool polivinilic prin inversie de faza umeda, urmata de activarea (concomitenta cu reticularea) polimerului membranar si apoi de imobilizarea covalenta a enzimei pe gruparile aldehidice nereactionate permite imobilizarea a circa 7,5 % (masic) enzima.

Pentru determinarea ionilor azotit si azotat din probe de ape, in vederea compararii rezultatelor biosenzorilor cu alte metode de analiza, s-au evaluat doua metode cromatografice, una cu detectie in UV si alta bazata pe determinarea conductivitatii. Datorita unei limite de detectie ridicate pentru NO^3-, de aprox 50 mg/L, precum si a unei separari cromatografice deficitare a ionilor azotat si azotit s-a renuntat la metoda cu detectie in UV.

Pentru metoda cromatografica care utilizeaza detector de conductivitate s-a apreciat:

- exactitatea prin determinarea repetabilitatii, obtinandu-se valori ale RDS de 2,39 si 2,93 pentru azotit, respectiv azotat;

- limita de detectie care pentru azotit a fost de 0,34 mg/L, iar pentru azotat de 0,56 mg/L;

- linearitatea - valorile coeficientilor de linearitate avand valori de: 0,9998 pentru curba de calibrare a azotitului (10-100 mg/L) de potasiu si 0,9952 (5-125 mg/L) pentru azotatul de potasiu.

Studiile de literatura si cercetarile preliminare au dovedit fezabilitatea temei propuse.

Rezumat Etapa 2

Nitratii si nitritii sunt intens folositi ca ingrasaminte sau conservanti. Insa, expunerea continua a fiintelor umane la acesti ioni poate avea implicatii serioase asupra sanatatii. Nitratii pot reactiona ireversibil cu hemoglobina producand methemoglobina, reducand astfel capacitatea sangelui de a transporta oxigenul. Afectiunea este cunoscuta sub denumirea de "blue baby syndrome". Extrem de periculosi sunt nitritii, care pot conduce la formarea in traiectul digestiv a nitrozoaminelor, cu caracter cancerigen.

In majoritatea tarilor industrializate, constientizarea acestui pericol a facut, ca sa devina obligatorie detectia, determinarea si monitorizarea nitritilor in probele de mediu, de alimente si fiziologice. Comunitatea europeana, prin Directiva europeana pentru apa de baut, din 1998, a stabilit nivele maxim admisibile (CMA) de nitrat si nitrit in apa potabila la valorile de 50 si respectiv 0,1 mg/l. Aceste nivele au devenit obligatorii si in Romania, prin legea nr. 458 din 8 iulie 2002, cu respectarea formulei: Nitrat/50 + Nitrit/3 < 1 mg/L. De aceea, problema monitorizarii continutului de nitrati si nitriti din apele destinate consumului uman (apa potabila, apa pentru prepararea alimentelor, etc) este in atentia organismelor specializate.

Metodele de diagnosticare bazate pe enzime sunt preferate fata de celelalte metode, datorita selectivitatii, sensibilitatii si unei mai mari exactitati. Utilizarea unor enzime libere prezinta dezavantaje precum costul ridicat datorat utilizarii doar o singura data si stablitatii limitate, care au fost inlaturate prin imobilizarea de enzime pe suport insolubil.

Cercetarile efectuate in etapa a 2-a a proiectului Bioenzinit, de catre coordonatorul proiectului - INCDCP-ICECHIM Bucuresti au avut ca scop obtinerea de polimeri electroconductivi. In acest sens s-au elaborat 2 metode de sinteza a polipirolului: una cu initiere de catre FeCl₃ si una cu initiere cu persulfat de aminiu. Aceste metode au permis obtinerea in laborator a cantitatilor de polipirol necesare cercetarilor de acetalizare si imobilizare covalenta, dar nu au permis depunerea polipirolului pe senzorii screen printed, cu electrod de carbune.

Cercetarile de acetalizare si imobilizare covalenta a peroxidazei au avut ca scop stabilirea in linii mari a retetelor si conditiilor acestor tratamente, atat pe pulbere de polipirol cat si pe polipirolul depus electrochimic pe senzorul central de carbune. In urma cercetarilor s-au obtinut probe de polipirol acetalizat si continand enzima imobilizata si electrozii corespunzatori, care au fost transmise partenerilor in vederea caracterizarii.

A fost abordat studiul comportamentului electrochimic al [Fe(CN)₆]^3-, pe diferite tipuri de electrozi (carbon vitros, aur, platina, electrozi miniaturizati de tip DropSens si electrozi modificati prin electrodepunerea filmelor de polipirol). Cu ajutorul electrozilor planari de tip DropSens cu grafit modificati cu peroxidaza inglobata in filme de polipirol s-a dovedit existenta unei interactiuni intre enzima imobilizata si specia electroactiva a paracetamolului, generata enzimatic in prezenta peroxidului de hidrogen (N-acetilbenzochinonimina - NAPQI). Metoda utilizata pentru aceste determinari a fost cronoamperometria.

S-au realizat studii de voltametrie ciclica pentru determinarea influentei diferitilor parametri (mediu electrolitic, material electrodic, pH), asupra proceselor de reducere electrochimica a nitratilor, respectiv de oxidare electrochimica a nitritilor, in vederea determinarii conditiilor optime de lucru.

In perspectiva, se are in vedere elaborarea unor biosenzori miniaturizati pe baza de enzime imobilizate in polimeri pentru determinarea calitativa si cantitativa a nitratilor si nitritilor din ape destinate consumului uman.

S-au efectuat analize ale apei freatice din unele localitati din judetul Giugiu si Teleorman pentru a se stabili continutul lor de nitrati si nitriti. Analizele s-au efectuat prin metode clasice: HPLC si spectroscopie UV-VIS. Se poate afirma ca in anumite zone rurale contaminarea cu nitrat a apelor subterane ce sunt utilizate ca apa potabila atinge cote alarmante. Dat fiind riscul crescut pe care aceste surse de apa le prezinta pentru sanatatea populatiei se impune o monitorizare eficienta in ceea ce priveste continutul de nitrati si nitriti a acestora.

Caracterizarea structurala a compozitelor polimerice prin SEM a evidentiat schimbari morfologice insemnate datorita procesului de acetalizare si ulterior de imobilizare covalenta a enzimei.

Determinarile de raze X, pe probele de polipirol netratat, polipirol acetalizat si polipirol cu enzima au demonstrat ca toate produsele au o structura amorfa, dar se pot evidentia schimbari structurale, dovedite de modificarile benzilor de difractie.

In ceea ce priveste analizele fizico-chimice privind polimerii si nanocompozitele membranare continand enzime, determinarile de spectroscopie in infrarosu cu transformata Fourier (FTIR) si de continut de azot au demonstrat ca se produce acetalizarea polipirolului cu aldehida glutarica si ca pe acest polimer modificat are loc imobilizarea covalenta a horseradish peroxidazei.

Rezumat Etapa 3

Poluarea apelor cu compusi cu azot: nitrati, nitriti si amoniu este o problema de larg interes si deosebit de stringenta. Nitratii pot reactiona ireversibil cu hemoglobina producand methemoglobina, reducand astfel capacitatea sangelui de a transporta oxigenul. Afectiunea este cunoscuta sub denumirea de "blue baby syndrome". Extrem de periculosi sunt nitritii, care pot conduce la formarea in traiectul digestiv a nitrozoaminelor, cu caracter cancerigen.

Cercetarile desfasurate in cea de a 3-a etapa a proiectului au fost dirijate in 2 directii:

- Obtinerea de biosenzori pe baza de polipirol obtinut prin polimerizarea chimica (oxidativa), in care enzima a fost imobilizata covalent dupa functionalizartea polimerului cu glutardialdehida;

- Obtinerea de biosenzori prin inglobarea enzimei in filmul polimeric de pe suprafata electrodului, obtinut prin polimerizarea electrochimica a pirolului.

1. Cercetarile efectuate pe prima directie au urmarit optimizarea conditiilor de functionalizare a polipirolului, prin cercetarea influentei diferitilor parametri ai procesului: raport aldehida glutarica: polipirol, concentratie de catalizator, raport solid: lichid, temperatura si durata de reactie. Cercetarile au fost continuate cu imobilizarea covalenta a enzimei pe polimer prin reactia gruparilor nereactionate ale dialdehidei cu gruparile NH sau COOH ale proteinei enzimatice.

Spectrele FTIR au dovedit ca prin functionalizarea PPy structura chimica a acestuia se modifica, intrucat apar peak-uri asociate grupelor -OH. In plus, mai apar peak-uri la ~2850-2920 cm^-1 care sunt asociate vibratiei de intindere a grupelor CH₂ care apar in urma legarii GA.

Prin functionalizarea PPy, stabilitatea sa se reduce. Asa cum arata analizele TGA, PPy functionalizat, la fel ca si PPy pur prezinta doua trepte de descompunere, dar, in cazul probelor functionalizate temperatura maximelor e deplasata catre temperaturi inferioare. Aceasta se datoreaza cresterii continutului de grupari laterale alifatice care fac structura mai putin stabila. De asemenea, intrucat structura PPy devine mai flexibila in urma functionalizarii, modulul de stocare scade fata de PPY, asa cum arata analizele DMA. Analizele DMA si TGA si spectrele FTIR au dovedit functionalizarea PPy prin reactia cu GA. De asemenea, spectrele FTIR au confirmat imobilizarea covalenta a PPOx pe PPy functionalizat.

2. Cercetarile privind obtinerea senzorilor prin inglobarea enzimei in filmul de polimer electroconductiv obtinut prin polimerizare electrochimica au fost dirijate spre inglobarea nitrat reductazei in filmul de polipirol. Cercetarile au fost efectuate pe diferite tipuri de senzori: pasta de carbune, carbon vitros si electrod DropSens de grafit.
S-au incercat diferite metode de depunere a polimerului si de inglobare a enzimei si utilizarea a diferiti mediatori.

Obiectivul principal in etapa a 3-a a proiectului a fost reprezentat de studiul comportamentului electrochimic al unor electrozi modificati cu filme polimerice conductoare, de tipul polipirolului, cu scopul de a elabora configuratii de biosenzori pentru detectia si cuantificarea nitratilor din diferite matrici.

Permeabilitatea filmelor polimerice realizate a fost testata in prezenta cuplului redox ferocianura/fericianura de potasiu.

In cazul electrozilor planari imprimati, cu suprafata de lucru din grafit, pe care a fost imobilizata peroxidaza din hrean in filme de polipirol, interactiunile intre enzima imobilizata si speciile electroactive ale paracetamolului (N-acetyl-p-benzo-quinone imine), generate pe cale enzimatica, in prezenta apei oxigenate au fost demonstrate prin cronoamperometrie.

Comportamentul electrochimic al nitratilor/nitritilor in cazul proceselor electrochimice de reducere si oxidare a fost studiat pe diferite materiale electrodice si la diferite valori ale pH-ului. Ambele procese de reducere, respective oxidare au fost favorizate de valori reduse ale pH-ului.

In vederea elaborarii unei configuratii de biosenzor pentru detectia si cuantificarea nitratilor a fost studiat comportamentul diferitilor parametri: electrolit, materialul electrodic si pH, pentru a determina conditiile experimentale optime.

In acelasi timp s-au efectuat analize complete ale apelor din fantanile din 3 localitati de campie, din jud. Teleorman, prin metode calsice, pentru a se identifica starea de fapt a acestor ape potabile si influenta pe care alti componenti din ape (in special oxigemul dizolvat si pesticidele clorurate) o pot avea asupra continutlui de nitrati si nitriti din ape, stiind ca o anumita cantitate din acesti anioni rezulta si in urma transformarii cationului amoniu.
Pe baza unui studiu foarte atent, in decurs de circa 1 an de zile, s-a constatat ca limita admisibila a nitratului si nitritului din apele potabile este aproape permanent depasita, cu exceptia captarilor de la mare adancime (peste 50 m). Aceasta situatie justifica cercetarile in vederea gasirii unor metode rapide de identificare a apelor potabile de calitate necorespunzatoare, pentru a se evita consumul acestora.

Analiza fizico-structurala prin FTIR a polipirolului functionalizat si a polipirolului functionalizat si continand enzima, comparativ cu polipirolul netratat a aratat ca apar modificari ale benzilor de absorbtie, care sugereaza atat functionalizarea cat si imobilizarea covalenta. Dovezi privind functionalizarea polipirolului cu glutardialdehida si privind imobilizarea covalenta a enzimei au fost aduse si de caracterizarea prin spectroscopiue Raman si DSC. Cele mai evidente dovezi ale imobilizarii enzimei model (polifenoloxidaza) pe suprafata granulelor de polipirol au fost aduse de difractia cu raze X si de microfotografiile SEM.